Immobilisation de l'α-Amylase (de source: Aspergillus Oryzae) sur un polysaccharide biodégradable : application hydrolyse des amidons de pomme de terre locale

Abstract

Le présent travail se résume en l'immobilisation de l'α-amylase sur un polysaccharide alguaire, l'alginate de sodium, par adsorption et greffage chimique et la préparation d'une matrice de biocatalyseur sous forme de billes par gélification, en l'isolation et la caractérisation partielle du substrat (amidon) à partir d'une matière première local (pomme de terre du sud de l'Algérie) et enfin en l'étude cinétique d'hydrolyse de l'enzyme immobilisée chimiquement sur des amidons extraits dans différentes conditions. Avant d'effectuer l'immobilisation, des tests de stabilité de deux supports polysaccharidiques (la carboxymethyl cellulose ou CMC, et l'alginate de sodium) en présence de L'α-amylase ont été réalisés, par la mesure de la distribution des masses moléculaires par chromatographie d'exclusion stérique couplée à la diffraction de la lumière laser (SEC/MALLS) de ces polymères seuls et après contact de l'enzyme. L'analyse a montré une dégradabilité de la CMC. Trois alginates (A),(B) et (C), ayant montré une stabilité vis-à-vis de l'α-amylase, ont été choisis pour l'immobilisation. Deux méthodes d'immobilisation ont été effectuées: La première est une méthode physique se basant sur l'adsorption de l'enzyme sur l'alginate suivie par gélification et formation des billes, la deuxième méthode se base sur l'activation de l'alginate par l'EDCI (1- éthyl-3- [3-(diméthyl amino)- propyl] carbodiimide hydrochlorique) dans un milieu aqueux suivie par un attachement chimique. L'alginate greffé chimiquement a été réticulé sous forme de billes. L'efficacité de l'immobilisation a été démontrée par la mesure de la distribution des masses moléculaires par SEC/MALLS et les taux d'azote et de carbone des alginates dans les différentes étapes d'immobilisation. Les modèles mathématiques de calcul proposés ont permis d'estimer le degré d'activation des alginates par l'EDCI et les taux d'immobilisation par les deux méthodes. L'influence de certains facteurs sur le taux d'immobilisation physique a montré que les concentrations en enzyme et en alginate de 3g/l et 10g/l respectivement donnent les meilleurs taux de fixation de l'amylase à un pH de 4,7 avec une valeur plus élevée pour l'alginate C (M/G=0,5). Le rendement maximal pour l'immobilisation chimique est observé pour une concentration en enzyme 2g/l, un pH=4,7, un rapport R(nEDCI/nan,alg)=0,5, M/G=1,2 et une concentration en alginate de 18g/l. Deux méthodes d'extraction humides de l'amidon, à partir de la pomme de terre locale, ont été testées: la méthode bisulfite et la méthode alcaline. La méthode bisulfite donne un rendement élevé comparé à la méthode alcaline (56,1% devant 38,9% par matière première sèche). Cependant, l'extrait d'amidon obtenu par la méthode alcaline est plus pur (99,31% d'amidon total contre 97,39%). L'étude cinétique de l'hydrolyse des amidons de pomme de terre extraits par les deux méthodes, par l'enzyme libre ou immobilisée par voie chimique, montre que cette cinétique obéit au modèle de Michaelis-Menten. Les valeurs des paramètres cinétiques Km et Vmax dépendent des méthodes d'extraction et de l'état de l'enzyme.